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泛素结合酶UBE2T调控胃癌细胞的分子研究

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放大字体  缩小字体    发布日期:2019-08-13  来源:曝光台  作者:baoguangtai  浏览次数:685
罗长江   摘要:泛素结合酶(E2酶)通过催化泛素与靶蛋白连接后被蛋白酶体降解。该实验研究了UBE2T对胃癌发生发展的作用,结果显示:UBE2T在胃癌组织和胃癌细胞中高表达;si RNA介导的抑制UBE2T表达通过阻滞细胞周期在G2/M期和促进细胞凋亡进而抑制胃癌细胞增殖和集落形成;抑制UBE2T表达通过改变上皮-间质转化(EMT)相关因子表达也可减缓胃癌细胞侵袭和转移能力;注射了抑制UBE2T表达的胃癌细胞的小鼠异种移植模型证实抑制UBE2T表达也可减缓体内肿瘤形成和生长;抑制UBE2T表达影响CCND1、Phospho-GSK3β、WNT家族成员和MYC的表达水平。以上结果表明UBE2T在胃癌中起关键作用,其可作为胃癌患者预后生物标志和治疗靶点。论文主要由下列五部分组成:一.胃癌细胞中UBE2T表达:为研究UBE2T对胃癌发生发展的作用,用免疫组化研究130例胃癌组织和39例癌旁组织的UBE2T表达。结果显示胃癌组织中UBE2T的表达明显高于癌旁组织。UBE2T高表达胃癌组织样本数高于癌旁组织(P0.05)。然后,研究不同分化程度胃癌样本的UBE2T表达,没有观察到显著性的分化依赖性差异(P0.05)二.si RNA介导抑制胃癌细胞中UBE2T表达:基于UBE2T表达与癌症发生相关,我们研究抑制UBE2T表达能否抑制和减缓胃癌增殖、侵袭和转移。用si RNA抑制三种常见胃癌细胞株SGC-7901,BGC-823和AGS细胞中UBE2T的表达。用嘌呤霉素抗性筛选和绿色荧光蛋白(GFP)检测确定在SGC-7901、BGC-823和AGS细胞中si RNA慢病毒感染是否成功;实时定量PCR测定UBE2T表达;GAPDH作为内参基因对照,分析UBE2T的相对表达水平(UBE2T/GAPDH)。该实验结果提示si RNA成功抑制SGC-7901,BGC-823和AGS细胞中UBE2T基因的表达(P0.01)。蛋白印迹(Western blotting)结果显示UBE2T蛋白表达在SGC-7901、BGC-823和AGS细胞中显著降低。三.抑制胃癌细胞中UBE2T可减缓其侵袭和转移能力:肿瘤细胞侵袭和转移导致其他组织和器官形成继发性肿瘤,是癌症相关发病和死亡的主要原因。因此,该实验研究了UBE2T对胃癌细胞AGS和SGC-7901侵袭和转移能力的作用。通过划痕试验和基质包被转孔实验发现抑制UBE2T可减缓AGS和SGC-7901细胞移行和侵袭。测试细胞划痕试验中细胞生长8小时和24小时后AGS和SGC-7901细胞移行率,发现sh UBE2T组显著低于sh Ctrl组(P0.01;SGC-7901生长24小时后,P0.05)。sh UBE2T组与sh Ctrl组比较,AGS和SGC-7901细胞侵袭性被显著抑制(P0.01)。然而,不同类型细胞的细胞粘附试验,sh UBE2T组和sh Ctrl组细胞粘附率没有显著性差异(P0.05)四.抑制UBE2T表达可减缓体内肿瘤形成和生长:分别注射si RNA慢病毒感染沉默UBE2T的BGC-823胃癌细胞(UBE2T沉默组KD)和未处理的BGC-823细胞(阴性对照组NC)到裸鼠的皮下。两组均为10只小鼠。对照组肿瘤快速生长并成瘤,表明胃癌细胞快速增殖。相比之下,UBE2T沉默组肿瘤增殖较慢。小鼠在注射后第18天处死并采集肿瘤标本。NC组肿瘤瘤体体积和质量显著大于KD组(P0.01)。这些结果表明体内抑制UBET2表达可抑制人胃癌细胞增殖和成瘤能力。五.UBET2参与的信号通路分析、相关信号因子和网络分析:为探讨胃癌中UBE2T的调控作用,对来自NC和KD组3个样本的基因芯片结果进行通路分析。分析前确认芯片结果质量。分析每组样本均做了泊松相关信号值等相关性验证。系统聚类图识别两组间基因表达的差异。与对照组相比,KD组有226个基因上调,有282个基因下调。结果发现许多细胞事件,如生长、增殖、运动、凋亡和生存,都参与调控UBE2T。与NC组比较,KD组CDH1、Phospho-GSK3β、WNT7B和WNT5A的m RNA表达水平增加。相反,CCND1和MYC的m RNA表达水平在KD组降低。蛋白印迹所得结果与实时定量PCR结果一致。实验发现,KD组的WNT7B、MYC和WNT5A蛋白表达降低,NC组几乎检测不到。KD组Phospho-GSK3B蛋白质表达增加42.1%。相比,NC组CDH1蛋白表达降低,KD组表达增加。KD组CCND1蛋白表达下降85.2%。除WNT7B和WNT5A外,虽然其它蛋白表达降低,但m RNA表达不变,观察到的所有因子的m RNA和蛋白均有相似变化。这些结果和以往研究表明UBE2T可能在胃癌中发挥关键作用,其可作为胃癌患者潜在的生物标志和治疗靶点。 学位授予单位:兰州大学
学位级别:博士
学位授予年份:2019
分类号:R735.2

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