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凋亡抑制蛋白拮抗剂对肿瘤细胞自噬的调节作用及机制研究

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放大字体  缩小字体    发布日期:2019-09-11  来源:曝光台  作者:baoguangtai  浏览次数:248
丁锐   摘要:诱导肿瘤细胞凋亡以摧毁癌细胞是肿瘤化疗的主要策略之一。近年来,随着对细胞死亡机制研究的深入和细化,基于自噬、程序性坏死等死亡方式诱导肿瘤细胞死亡成为抗肿瘤药物研究的新方向。然而,细胞凋亡与自噬关系复杂,尽管它们共享多个重要的调控分子,但调节机制尚不清楚。因此,研究抗肿瘤药物诱发的细胞凋亡与自噬间的相互关系对于认识肿瘤细胞的调控机制、发现长期获益的肿瘤治疗药物具有重要价值。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是一类重要的细胞凋亡抑制蛋白,与肿瘤发生发展密切相关,其拮抗剂作为抗肿瘤候选药物已进入临床研究的不同阶段。大量的基础与临床前研究表明,IAP拮抗剂选择性地结合到XIAP、cIAP1、cIAP2的BIR3结构域,激活细胞内源与外源性凋亡通路,诱导肿瘤细胞凋亡。近年来,一些IAP拮抗剂及其靶蛋白XIAP和cIAP1/2也被发现参与了肿瘤细胞自噬的调节,然而,有关调节机制的报道结论不一,缺乏系统的实验研究和信息。本课题组在2013年筛选新型IAP拮抗剂的实验中发现,IAP拮抗剂除诱导肿瘤细胞凋亡外,还对细胞自噬表现出不同程度的调节活性,且具有明显的肿瘤细胞特异性。鉴于IAP拮抗剂既特异地诱导细胞凋亡,又参与细胞自噬调节,本课题拟系统开展IAP拮抗剂的自噬调节机制研究,以进一步阐明IAP拮抗剂的抗肿瘤机制,揭示细胞凋亡与自噬的相互关系,为该类抗癌药物的开发提供理论依据。本论文的研究工作分为两部分。第一部分工作基于筛选发现本所合成的新型单体IAP拮抗剂WX20120108(GDC-0152类似物)具有更强的抗肿瘤活性和极强的细胞自噬调节活性,首先通过靶蛋白虚拟对接分析、靶蛋白结合和功能分析、靶蛋白相关NF-κB通路激活分析及细胞凋亡诱导等实验确证WX20120108具有典型IAP拮抗剂的生物学特性。在此基础上,以HeLa和MDA-MB-231细胞为实验对象,探查了WX20120108调节肿瘤细胞自噬的作用及其机制。免疫荧光高内涵分析、免疫印迹和透射电镜观察显示,WX20120108浓度(1-30μM)和时间(6-48 h)依赖地促进细胞自噬标志分子LC3B颗粒聚集,增加LC3B-II、p62蛋白表达,并在细胞中形成自噬体结构;自噬阻滞剂氯喹(chloroquine,CQ)显著增加WX20120108诱导的LC3B-II的含量,而WX20120108促进自噬体与溶酶体共定位,并促进溶酶体组织蛋白酶B(CTSB)与CTSD的活性。12株稳定表达EGFP-自噬起始相关信号蛋白的报告细胞系筛查和HeLa细胞验证实验发现WX20120108选择性地激活FOXOs蛋白家族,特别是Foxo3,具有浓度依赖关系,同时促进其下游靶基因Bnip3、Pik3c3、Atg4b和Atg5的上调,而这些基因表达产物是自噬起始的关键蛋白;进一步,Foxo3激活的调节机制的筛查显示,WX20120108促进细胞ROS释放,且WX20120108激活Foxo3、LC3B-II聚集作用可被自由基螯合剂过氧化氢酶catalase拮抗;而采用RNAi技术沉默靶蛋白XIAP、cIAP1和cIAP2不影响WX20120108诱导的ROS释放和Foxo3激活,仅在cIAP1/2沉默时降低WX20120108诱导的自噬水平。最后,本实验还发现,伴随WX20120108诱导细胞自噬程度增加,死亡细胞数量增加;泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK对WX20120108导致的细胞死亡具有保护作用,但不影响其自噬活性。综合以上实验结果可以看出,新型IAP拮抗剂WX20120108在其适应症的肿瘤细胞系HeLa和MDA-MB-231细胞上具有诱导细胞自噬的作用,该作用除部分依赖于靶蛋白cIAP1/2外,靶标非依赖的ROS-Foxo3通路激活是WX20120108诱发持续自噬的主要因素。此外,WX20120108先诱导自噬性细胞死亡,然后发生细胞凋亡,自噬如何促进凋亡发生,其机制有待进一研究。第二部分工作以已进入临床试验阶段的单体IAP拮抗剂GDC-0152和双体IAP拮抗剂TL32711为工具化合物,以HeLa和MDA-MB-231细胞为研究对象,探查了经典IAP拮抗剂对肿瘤细胞自噬的调节作用及其机制。与第一部分采用的实验方法基本一致。免疫荧光HCA、Western blot分析及透射电镜观察发现GDC-0152和TL32711都具有自噬调节活性;进一步,通过自噬流检测、自噬底物p62蛋白及mRNA水平检测、自噬体与溶酶体共定位分析、溶酶体酶活性检测发现GDC-0152和TL32711均能够促进自噬流,是细胞自噬的诱导剂,不同于单给药,在氯喹(CQ)存在时,双体拮抗剂TL32711诱导更多LC3B-II生成。敲减药靶发现,敲减XIAP和cIAP1/2均抑制TL32711的自噬活性,而GDC-0152的自噬调节活性仅在敲减cIAP1/2时被显著抑制。自噬调节活性的动态检测显示,两个拮抗剂均浓度和时间依赖地提高细胞LC3B蛋白水平,并伴有细胞数量的减少;流式细胞凋亡分析、HCA细胞坏死检测、细胞乳酸脱氢酶释放检测结合泛caspase抑制剂、程序性坏死抑制剂necrostatin-1及自噬抑制剂3-MA,确证两IAP拮抗剂诱导caspase依赖的肿瘤细胞凋亡及程序性坏死,而且化合物的自噬调节作用不受其凋亡诱导活性的影响。鉴于GDC-0152和TL32711促进自噬流却增加或不降低自噬底物p62水平,进行了p62 mRNA含量、p62与溶酶体、p62与RIP1蛋白的免疫荧光共定位和免疫共沉淀分析,结果两拮抗剂不同程度增加p62基因表达,TL32711处理细胞后p62部分与溶酶体共定位,GDC-0152处理细胞后p62与RIP1结合。综合上述结果可以看出:单体IAP拮抗剂GDC-0152和双体IAP拮抗剂TL32711在HeLa和MDA-MB-231细胞上均具有自噬诱导活性,该活性分别是cIAP1/2或cIAP1/2和XIAP依赖的;两拮抗剂通过自噬促进了肿瘤细胞凋亡的发生;二者还可以诱导一定程度的程序性坏死,其中GDC-0152通过介导p62与RIP1蛋白的相互作用,促进坏死小体的形成而诱导程序性坏死的发生。本课题首次系统探讨了不同类型IAP拮抗剂的自噬调节作用及机制,综合两部分的研究工作可得出以下研究结论:1)IAP拮抗剂在其适应症的肿瘤细胞系上具有诱导肿瘤细胞自噬的作用;2)IAP拮抗剂诱导肿瘤细胞自噬作用既存在靶标依赖性也存在靶标非依赖的机制,其中单体拮抗剂依赖于cIAP1/2,而双体依赖于XIAP和cIAP1/2;此外,GDC-0152及其类似物新IAP拮抗剂WX20120108还不同程度地激活ROS-Foxo3通路,诱导肿瘤细胞自噬。提示,IAP拮抗剂诱导自噬的作用决定于其自身的结构。3)IAP拮抗剂诱导的持续的细胞自噬促进了细胞凋亡,此外,程序性坏死也是IAP拮抗剂诱导细胞死亡的方式之一,并与p62密切相关。 学位授予单位:军事科学院
学位级别:博士
学位授予年份:2019
分类号:R96

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