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HepaRG和HepG2聚球体模型的建立及药物体外肝毒性检测的对比研究

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放大字体  缩小字体    发布日期:2019-09-11  来源:曝光台  作者:baoguangtai  浏览次数:479
孟镇锴   摘要:目的安全性是药物研发领域最核心的基本原则,药物诱导性肝毒性是毒理学领域的研究重点。随着现代化工和制药技术的进步,人们开发化合物的速度越来越快,合成的数量越来越多,这便对于体外药物肝毒性筛选模型提出了更高要求,寻找并构建更加灵敏高效的体外模型意义重大。细胞体外三维(three-dimentional,3D)类组织聚球体培养作为近年来的研究热点,相比常规二维(two-dimentional,2D)细胞培养可以更好地模拟细胞和组织功能,提升建模效果。HepaRG和HepG2细胞的类组织聚球体模型在体外药物肝毒性的研究上应用较多,但针对性比较二者在形态学、生化功能、药物检测敏感度之间的差异的研究相对较少,选择何种模型进行体外肝毒性检测更加合适尚缺乏详细的研究。本课题拟对HepaRG和HepG2细胞进行体外3D细胞聚球体模型构建,对比研究二者在形态学、生长规律、功能蛋白表达、尿素代谢合成、糖原储存、体外药物肝毒性检测上的差异,为选择更加适合的体外药物肝毒性检测模型提供相关参考依据。方法在U形底低吸附96孔板中以100、200、400、800、1600个/孔的细胞密度对HepaRG和HepG2细胞进行体外三维聚球体模型的构建,记录接种后第3、7、10、14、21、28天的形态学变化,比较二者生长差异,探究最佳接种密度和时间节点;于接种后第7、10、14天对HepaRG和HepG2细胞聚球体(100个/孔密度组)进行苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色,观察两模型内部细胞生长情况;利用实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR,qRT-PCR)技术检测接种后第7、10、14天的HepaRG和HepG2细胞聚球体(100个/孔密度组)的核受体、代谢I相酶、II相酶、转运体和白蛋白的mRNA的表达水平;利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)、Western蛋白质印记(Western blotting,WB)技术对接种后第10天的HepaRG和HepG2细胞聚球体(100个/孔密度组)进行检测,比较二者代谢I相酶、II相酶、转运体、白蛋白在蛋白水平的表达;对接种后第7、10、14天的HepaRG和HepG2细胞聚球体(100个/孔密度组)进行氯化铵代谢实验,比较二者尿素生成水平差异;对接种后第10天的两细胞聚球体(100个/孔密度组)进行过碘酸-雪夫(periodic acid schiff stain,PAS)染色,观察二者糖原储存情况;选取14种药物(阳性对照药11种,阴性药3种)进行单次和重复剂量细胞毒性实验,检测细胞存活率并计算不同药物单次和重复给药下对两种细胞聚球体的半数抑制剂量(half maximal inhibitory concentration,IC_(50)),比较HepaRG和HepG2细胞聚球对药物肝毒性敏感度差异。结果两细胞聚球体直径随初始接种细胞密度的增大而增大,随培养天数增加体积不断增长,以100个/孔密度组模型满足直径参考范围较好,为最佳接种密度;HE染色显示第14天的HepaRG和HepG2细胞聚球体平均坏死直径分别116.2±13.4μm和200.2±44.3μm,HepaRG细胞聚球体坏死范围较小(P0.05);qRT-PCR结果显示HepaRG细胞聚球体多种蛋白的mRNA表达明显高于HepG2细胞聚球体(P0.05,P0.01),其接种后第7天有4种蛋白mRNA表达达峰值,第10天有9种达峰值,第14天有7种;IF结果显示HepaRG细胞聚球体多种功能蛋白在蛋白表达层面上均高于HepG2细胞聚球体(P0.05,P0.01);WB结果示HepaRG细胞聚球体的CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、GSTA1、GSTM1、UGT1A1、MRP2、ALB的表达水平分别为HepG2细胞聚球体的2.122、11.423、3.02、2.129、1.486、1.372、2.419、1.252、2.166、1.786倍;尿素检测结果显示HepaRG细胞聚球体相比同期HepG2细胞聚球体有更高的平均尿素生成水平(P0.01),HepaRG细胞聚球体尿素平均生成水平于接种后第7、10、14天分别为16.143±3.015、12.411±1.923和7.654±0.816 nmol/h·mm~3;PAS染色显示HepaRG和HepG2细胞聚球体均可储存和利用糖原;14种药物的细胞毒性实验结果显示,除3种免疫介导肝毒性的阳性药和3种阴性药外,其余8种阳性药均检测有明显肝细胞毒性,HepaRG细胞聚球体对药物毒性更加敏感,以重复给药下各药物显示的IC_(50)值最低,对乙酰氨基酚、苯溴马隆、非阿尿苷、丙戊酸、吲哚美辛、异烟肼、奈法唑酮、环磷酰胺的IC_(50)值分别为3.34 mM、0.35 mM、3.46mM、10.98 mM、6.32 mM、5.46 mM、1.37 mM、8.71 mM。结论HepaRG细胞类组织聚球体在直径控制、形态保持、功能蛋白表达、尿素代谢合成、药物肝毒性检测方面均较HepG2细胞聚球体更具优势,是更为合适的体外肝毒性评价模型。 学位授予单位:军事科学院
学位级别:硕士
学位授予年份:2019
分类号:R96

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